Compartimentation et dynamique cellulaires

Notre équipe étudie le processus de polarisation cellulaire dans le cadre de la migration cellulaire et de la division cellulaire. Une cellule est dite polarisée lorsqu'elle a développé un axe d'organisation principal. La polarisation peut se produire de manière spontanée ou bien être induite par des signaux externes tels que des gradients de molécules de signalisation, de lumière, des champs de forces ou même des champs électriques. Elle implique la réorganisation du cytosquelette de la cellule et des organelles intracellulaires, et elle aboutit à une réponse cellulaire spécifique : une migration ou une croissance directionnelle, une division orientée, une sécrétion orientée, etc.

Le projet de notre équipe est de comprendre à la fois les mécanismes moléculaires et les principes physiques qui régissent la polarité cellulaire. À cette fin, nous utilisons et développons des outils innovants basés sur des techniques de microfabrication afin de contrôler les principaux paramètres physiques et chimiques du microenvironnement cellulaire. Ces outils sont couplés à une microscopie quantitative de haute qualité, ainsi qu'aux techniques de biologie moléculaire et cellulaires classiques, l'ensemble apportant une description quantitative du comportement cellulaire. 

L'originalité de notre approche réside dans l'association de plusieurs domaines de compétence (physico-chimie, physique de la matière molle et biologie cellulaire) au sein d'une même équipe afin de répondre à une question biologique fondamentale : quels sont les mécanismes impliqués dans la polarisation des cellules ? Répondre à cette question devrait apporter de nouvelles notions et des outils innovants, avec une application potentielle en biomédecine.

Fig. 1Le micromatriçage («micropatterning» en anglais) de protéines d'adhésion cellulaire telles que la fibronectine (en rouge sur les images en haut à gauche, et en vert sur celles d'en haut à droite) permet de contrôler de manière précise la géométrie de l'adhésion cellulaire et induit une organisation stéréotypée des compartiments cellulaires (en bas à droite) et un axe de division cellulaire prédictible (en haut à gauche). Nous utilisons également des substrats déformables pour appliquer des contraintes sur les cellules en division et pour étudier l'effet de la rigidité du substrat sur la polarisation cellulaire (en bas à gauche).

Contrôle du microenvironnement des cellules en culture avec des outils microfabriqués

In vivo, les cellules doivent faire face à un environnement complexe tandis qu'in vitro, même si les cellules sont plus propices à l'expérimentation, les conditions de culture sont souvent ultra-simplifiées, voire même complètement artéfactuelles. Grâce aux récents progrès qui ont été réalisés en microfabrication, nous sommes à même de développer nos propres micro-outils de laboratoire afin de contrôler l'adhésion cellulaire, les propriétés physiques du substrat, la forme des cellules, le microenvironnement chimique, etc. Ces techniques sont également compatibles avec la microfluidique qui nous permet de contrôler l'environnement chimique des cellules (drogues, nutriments, etc).
On peut s'attendre à ce que la possibilité de travailler dans des environnements contrôlés à l'échelle micrométrique représente une révolution comparable à celle provoquée par les progrès de la microscopie optique et de l'imagerie sur cellules vivantes au cours de la dernière décennie.

Actuellement, nous développons une méthode pour obtenir des micro-patrons adhésifs « dynamiques » dont la géométrie peut être modulée à volonté au cours de l'expérience. Cela nous permettra d'étudier la dynamique de la polarisation cellulaire et de provoquer des mouvements cellulaires dirigés, mais également de moduler la géométrie de l'adhésion cellulaire au cours de la division. Nous avons travaillé sur la fabrication de micro-patrons compatibles avec le criblage à haut débit et nous avons réussi à développer une technique de micromatriçage permettant l'assemblage de plaques de 96 puits micro-structurées. La prochaine étape sera de les tester sur une plate-forme de criblage et de rendre les techniques de micromatriçage et d'ARN interférent compatibles. CYTOO, une société située à Grenoble qui commercialise des lames et des plaques microstructurées basées sur nos développements technologues (brevet ACICO, ‘adhesive control of internal cell organization'), a été créée en 2008.

Migration cellulaire dans des environnements étroits

La migration cellulaire a été étudiée, pendant des années et avec grand succès, par microscopie sur des substrats en verre plat. Mais des études récentes ont montré que cela ne suffisait pas à fournir une vision complète des choses : l'environnement cellulaire dans un tissu vivant est extrêmement complexe, impliquant des interactions cellule/cellule ainsi que des interactions cellule/matrice. Pour comprendre les mécanismes de la migration cellulaire au sein des tissus, nous avons donc besoin de développer de nouvelles stratégies.

Des systèmes tels que des gels de collagène sont couramment utilisés comme modèles simplifiés pour étudier la migration cellulaire dans des environnements tridimensionnels. Mais les résultats sont difficiles à interpréter : beaucoup de paramètres physiques ayant un impact sur la motilité des cellules (parmi lesquels la densité du gel, son irrégularité, son élasticité) agissent simultanément. Afin de pouvoir évaluer l'impact de ces différents paramètres indépendament les uns des autres, nous proposons donc une approche expérimentale innovante basée sur la microfabrication (Faure-André et al., Science, 2008; Hawkins et al., PRL, in press).

Fig. 2Modélisation de la migration cellulaire dans les tissus à l'aide de simples dispositifs microfabriqués.
a) Les cellules migrant dans les tissus (en blanc) rencontrent un micro-environnement très complexe (interactions cellule/cellule, signalisation chimique, contraintes physiques).
b) Modèle de migration utilisant des gels de collagène tridimensionnels.
c) Les micro-canaux, de géométries et de propriétés physiques variées, permettent un très bon contrôle du micro-environnement cellulaire physique et chimique. Le mouvement des cellules est extrait sous forme d'un kymographe qui contient, sous un format compact, toutes les informations nécessaires à l'analyse des mouvements cellulaires (barre = 100µm). Les positions de l'avant, de l'arrière et du centre de masse des cellules sont extraites au niveau de chaque ligne du kymographe et utilisées pour mesurer les vitesses cellulaires instantanées (graphique du bas).

Des micro-canaux similaires ont été utilisés pour étudier la morphogenèse de la levure S. Pombe en collaboration avec l'équipe de Phong Tran et d'Anne Paoletti (Terrena et al. Curr Biol, 2008). Ce travail apporte la preuve directe que le cytosquelette contrôle la polarité cellulaire et la forme des cellules. Il démontre en outre que cette dernière contrôle également, via une boucle de rétroaction, l'organisation du cytosquelette. Notre modèle de boucle de rétroaction explique la manière dont les levures conservent une forme de bâtonnet, et comment la perturbation de paramètres spécifiques de cette boucle peut aboutir à des formes de cellule différentes.

Fig. 3Grâce à la microfluidique, l'environnement chimique de la cellule peut être contrôlé de manière précise, permettant la production de gradients spatiaux de protéines (en haut, à gauche: un gradient de phéromones, indiqué en rouge, est appliqué sur des levures bourgeonnantes S. Cerevisiae, ce qui induit leur polarisation). Réduire la taille des canaux à celle de la cellule, voire en dessous, produit des environnement étroits permettant de contrôler la forme de la levure S.Pombe (en haut, à droite), ou bien encore d'étudier la migration de cellules spécialisées du système immunitaire, comme les cellules dendritiques (en bas, à gauche).

Le rôle des forces exercées sur les cellules au cours de leur division

Evaluer les forces impliquées dans les processus cellulaires et comprendre leur rôle représentent l'un des principaux défis qui sont abordés par les approches physiques en biologie cellulaire. En effet, l'interaction des cellules avec leur environnement immédiat est en partie médiée par des signaux biochimiques, mais également par des signaux mécaniques (mécanotransduction). La plupart des études mesurant ou modifiant ces contraintes ont été réalisées in vitro, et presque toutes sur des cellules en interphase. Il se trouve que le plus souvent, les cellules en culture se détachent pratiquement du substrat lorsqu'elles entrent en mitose, ce qui pourrait expliquer pourquoi la mécanotransduction n'a pas été étudiée dans ce contexte. Néanmoins, elles conservent des liens, appelés fibres de rétraction, avec le substrat. La pertinence physiologique de ces liens, qui ont été très peu étudiés jusqu'à présent, n'a pas été démontrée avec exactitude. Cependant, de récentes études, dans lesquelles notre groupe a été impliqué, ont suggéré que ces fibres pouvaient fournir des informations spatiales aux cellules en division et être impliquées dans la mise en place de l'orientation du fuseau mitotique, et donc dans le contrôle de l'axe de division. Nous explorons aussi la possibilité que la mécanotransduction joue un rôle dans le contrôle de la toute dernière étape de la division cellulaire, l'abscission, dont l'échec peut aboutir à l'aneuploïdie et au cancer.

Fig. 4À gauche: image de cellule en mitose sur un micro-patron adhésif (actin en vert, qui marque les fibres de rétraction, molécules d'adhésion en rouge, chromosomes en bleu et pôles du fuseau en orange). En dessous un schéma explique le principe d'orientation du fuseau mitotique par l'interaction des microtubules astraux (en vert) avec le cortex cellulaire comportant des fibres de rétraction (en rouge). A droite: Evaluation du rôle des fibres de rétraction dans l'orientation du fuseau mitotique. Les cellules ont été ensemencées sur un micro-patron adhésif en croix et les fibres de rétraction ont été enlevées par ablation laser sur une branche de la croix au cours de la métaphase précoce. Cette ablation a entrainé une rotation de 90° du fuseau, les pôles faisant face aux fibres de rétraction restantes.

Brevet

Le contrôle adhésif de l'organisation cellulaire interne est une méthode efficace et peu coûteuse qui permet le criblage de gènes ou l'étude de l'activité de substances sur les fonctions cellulaires, parmi lesquelles la polarité, la motilité et la division ainsi que la compartimentalisation et le transport intra-cellulaire.

Bornens M, Thery M and Piel M : Methods and Device for Adhesive Control of Internal Cell Organization (ACICO). Mars 2005 (PCT : WO026313), mai 2007 (Europe : 1664266), février 2007 (USA : 004283-A1), mars 2007 (Japon : 504818).